Toute observation microscopique d'un tissu biologique passe par une coupe fine, bidimensionnelle, d'une structure qui existe en réalité en trois dimensions. Reconstruire fidèlement une information 3D (un nombre de cellules, un volume d'organe, une longueur de vaisseau) à partir de ces coupes plates est un problème géométrique à part entière, indépendant de la qualité de préparation du tissu ou de l'expertise de l'observateur.

Historiquement, les premières approches quantitatives reposaient sur des modèles mathématiques supposant une forme géométrique standard pour les objets comptés (sphères, ellipsoïdes...). Ces méthodes « model-based » produisaient des résultats fiables uniquement lorsque le tissu réel correspondait à l'hypothèse de départ — ce qui est rarement le cas en biologie. À partir des années 1980, sous l'impulsion de chercheurs comme Hans Jørgen Gundersen, la discipline s'est tournée vers des méthodes « design-based », où c'est le plan d'échantillonnage lui-même, et non une hypothèse sur la forme des objets, qui garantit l'absence de biais.

Toute méthode stéréologique non biaisée repose sur un échantillonnage qui combine un point de départ aléatoire et un intervalle systématique régulier, appliqué aussi bien au choix des coupes qu'à la position des champs observés sur chaque coupe. Ce principe garantit que chaque partie du tissu a une probabilité connue et égale d'être incluse dans l'analyse.

Le dissecteur est un petit volume tridimensionnel défini dans l'épaisseur d'une coupe, associé à des règles de comptage précises (lignes d'inclusion et d'exclusion). C'est l'outil central qui permet de compter des objets sans biais lié à leur taille — le même principe qui sous-tend le fractionneur optique.

Contrairement aux méthodes plus anciennes, les règles stéréologiques modernes (quel objet compter, dans quel volume, selon quel critère de mise au point) ne dépendent d'aucune supposition sur la forme des objets. Cela rend les résultats comparables entre différentes structures biologiques et différents laboratoires.

Le fractionneur optique reste la méthode de référence pour estimer un nombre total d'objets biologiques, en combinant échantillonnage systématique des coupes, échantillonnage systématique de la surface, et comptage par désecteur.

Le principe de Cavalieri permet d'estimer le volume d'une structure entière (un organe, une tumeur, une région cérébrale) en multipliant la somme des surfaces mesurées sur une série de coupes régulièrement espacées par la distance entre ces coupes — une méthode simple mais rigoureusement non biaisée.

Pour des structures comme les membranes cellulaires, les surfaces d'échange ou les réseaux vasculaires, des méthodes d'intersection avec des grilles de test permettent d'estimer surface totale et longueur totale sans avoir à reconstruire la structure en 3D.

La taille d'échantillon adéquate se détermine généralement via le coefficient d'erreur (CE) de l'estimation : plus le CE est bas, plus l'estimation est précise, mais au prix d'un temps de comptage plus long. Une règle pratique courante vise un CE inférieur à la variabilité biologique naturelle entre les sujets étudiés, pour ne pas ajouter de bruit méthodologique au signal biologique.