Un comptage visuel, même fait avec soin par un expert, produit presque toujours une estimation faussée. La raison n'est pas un manque de rigueur de l'observateur : c'est un biais géométrique inhérent à la façon dont une coupe de tissu, en deux dimensions, représente une structure en trois dimensions. Une même cellule peut apparaître sur plusieurs coupes consécutives, ou au contraire ne jamais être visible si elle tombe entre deux plans de coupe. Sans méthode corrective, le nombre obtenu dépend donc autant de l'épaisseur des coupes et de la taille des cellules que du nombre réel de cellules présentes.

Ce problème est connu depuis près d'un siècle : dès 1925, le statisticien Sven Wicksell avait démontré qu'une structure tridimensionnelle observée à travers une coupe plane introduit systématiquement une surestimation des objets les plus grands, car ceux-ci ont statistiquement plus de chances d'être « touchés » par le plan de coupe que les petits objets. Ce biais, aujourd'hui appelé « effet Wicksell » ou biais de recouvrement, explique pourquoi deux chercheurs comptant la même coupe avec des méthodes différentes peuvent obtenir des résultats significativement différents.

En stéréologie, une méthode est dite « non biaisée » lorsqu'elle ne repose sur aucune hypothèse concernant la taille, la forme ou l'orientation des objets comptés. Contrairement aux méthodes de comptage par densité qui supposent une distribution régulière des cellules, les méthodes non biaisées fonctionnent quelle que soit l'irrégularité réelle du tissu observé. C'est cette absence d'hypothèse qui rend les résultats comparables d'une étude à l'autre, d'un laboratoire à l'autre.

Le SURS (Systematic Uniform Random Sampling) consiste à choisir un point de départ aléatoire dans le tissu, puis à échantillonner les coupes suivantes à intervalles réguliers et prédéfinis. Ce mélange d'aléatoire (le point de départ) et de systématique (l'intervalle fixe) garantit que chaque partie du tissu a une chance égale d'être incluse dans l'échantillon, sans que le chercheur n'ait à faire de choix subjectif sur quelles zones observer.

Le fractionneur optique (optical fractionator), développé par Peter Sterio en 1984 puis affiné par Hans Jørgen Gundersen et son équipe, est aujourd'hui la méthode de référence pour estimer le nombre total de cellules dans une structure tissulaire.

Avant tout comptage, il faut délimiter précisément la structure anatomique à étudier (un noyau cérébral, une couche corticale, un organe entier) sur chaque coupe. Cette délimitation doit suivre des critères anatomiques reproductibles, idéalement définis à l'avance et appliqués de façon identique par tous les observateurs d'une même étude.

Sur l'ensemble des coupes sériées couvrant la structure, on sélectionne une fraction connue et régulière (par exemple une coupe sur cinq, sur dix...) en partant d'un point aléatoire parmi les premières coupes. Cette fraction devient le premier facteur de la formule finale.

Sur chaque coupe échantillonnée, des cadres de comptage sont positionnés selon une grille systématique aléatoire. Chaque cadre définit un « désecteur optique » : un petit volume tridimensionnel dans l'épaisseur de la coupe, à l'intérieur duquel les cellules seront effectivement comptées, avec une marge de sécurité en haut et en bas de la coupe pour éviter les artefacts de section.

Une cellule n'est comptée que si : elle est entièrement visible dans le volume du désecteur, elle ne touche pas les lignes d'exclusion du cadre (généralement deux des quatre côtés), et son point le plus haut (habituellement le sommet du noyau) apparaît pour la première fois dans le volume échantillonné. Ces règles, formalisées par Gundersen dès 1977, éliminent mathématiquement le biais de recouvrement décrit par Wicksell.

Le nombre total de cellules (N) s'obtient en multipliant le nombre de cellules comptées dans les désecteurs par l'inverse de chacune des fractions d'échantillonnage appliquées.

N = ΣQ⁻ × (1/ssf) × (1/asf) × (1/tsf)

où ΣQ⁻ est le nombre total de cellules comptées, ssf la fraction de coupes échantillonnées, asf la fraction de surface échantillonnée par les cadres de comptage, et tsf la fraction d'épaisseur de coupe utilisée pour le désecteur.

Exemple simplifié : si vous comptez 200 cellules (ΣQ⁻), avec une coupe sur dix échantillonnée (ssf = 1/10), des cadres couvrant 1/50 de la surface totale (asf = 1/50) et un désecteur utilisant 1/2 de l'épaisseur de coupe (tsf = 1/2), alors N = 200 × 10 × 50 × 2 = 200 000 cellules estimées.

Le logiciel StereoInvestigator (MBF Bioscience) domine le marché académique, mais des alternatives existent, dont certaines open-source, notamment pour les laboratoires disposant déjà d'un microscope motorisé mais cherchant à réduire les coûts de licence.